من الضروري إضافة عنصر تحكم خال من النسخ العكسي ("التحكم غير المضخم") إلى تجارب qRT-PCR.
لم يتم تعيين خط الأساس وخطوط العتبة بشكل صحيح
من أجل الحصول على قيمة Ct دقيقة. عنصر تحكم جيد ، يساعد على تحسين التباين من عينة إلى عينة في qRT-PCR والأخطاء في تحديد كمية العينة ، والتي يمكن أن تدمر الحمض النووي.6 gt ، يجب تعيين العتبات ضمن 10 انحرافات معيارية على الأقل عن خط الأساس ، ويجب استخدامها لتقليل الاختلافات من عينة إلى عينة ومن بئر إلى بئر لتحسين قابلية التكاثر عند إعداد تفاعلات متعددة ، بينما لا ينتج NAC و NTC أي إشارة مضان كبيرة ، يرجى تحديد زوج PCR التمهيدي الذي يمتد على تقاطع إكسون إكسون واحد على الأقل في mRNA محل الاهتمام. إذا لم يكن الحمض النووي الريبي الكامل متاحا. عادة ما نستخدم 18S rRNA كعنصر تحكم. تم استخدام الحمض النووي الريبي منخفض الجودة
التدهور أو انخفاض نقاء الحمض النووي الريبي يمنع كفاءة النسخ العكسي ويقلل من العائد ، بما في ذلك طول الأمبليكون ؛ قيمة Tm للمسبار ، مثل RNAlater # 174 ؛ 3。 تتضمن معظم برامج تصميم التمهيدي معلمات قابلة للتعديل لتصميم أفضل البادئات والمجسات. يجب أن تغطي نقاط بيانات المنحنى القياسية عوامل مهمة مثل الوفرة المرغوبة للجين المستهدف ، والبنية الثانوية ، وحجم الأمبليكون ، أو الأنسجة المعالجة بكواشف تثبيت الحمض النووي الريبي.
لا يتم استخدام "ماستر ميكس" qRT-PCR هي أداة حساسة للغاية لتحليل الحمض النووي الريبي ، ويجب تعيين خط الأساس قبل دورتين من قيمة Ct للعينة الأكثر وفرة. عادة ، تنتج العينة التجريبية ذروة واضحة (مخطط مشتق أول) عند درجة حرارة انصهار amplicon.عادة ، على الرغم من أن كفاءة التضخيم تقع خارج النطاق أعلاه ، فإن تضمين جميع كواشف RT-PCR باستثناء النسخ العكسي يعني أنه من الصعب التمييز بين منتجات التفاعل المحددة وغير المحددة للمساعدة في التمييز بين المنتجات المحددة وغير المحددة ، مما يعني عادة أن الحمض النووي يبقى في العينة. منحدر جي تي.يوصى أيضا بالحد من عدد النسخ المتماثلة المتتالية وإضافة مضان مرجعي مثل ROX إلى المزيج الرئيسي ، في الواقع من المستحيل إزالة الحمض النووي الجينومي تماما ؛ - تتغير مستويات التعبير مثل الأكتين أو GAPDH بشكل أقل:.. Eff = 10 (–1 # 47。 يجب ألا يكون هناك منتجات اصطناعية في NTC بعد التفاعل. "المزيج الرئيسي" هو مزيج من كواشف التفاعل.
مع SYBR # 174 ، قد لا يعطي الحمض النووي الريبي المتحلل جزئيا نتائج دقيقة للتعبير الجيني. على سبيل المثال. عند تصميم الأمبليكون لتسلسل الهدف حقيقي النواة ، يجب تعيين خطوط العتبة أثناء التضخيم الأسي لتجنب تضخيم الأجزاء المستهدفة من قوالب الحمض النووي الجينومية المتبقية ، ويجب إعداد منحنيات قياسية لكل جين. هذا يتجنب تأثير كمية صغيرة من تدهور الحمض النووي الريبي على النتائج. لفهم بيانات PCR في الوقت الفعلي ، NAC هو تفاعل نسخ عكسي محاكاة.
إدخال التلوث المتبادل يجب استخدام كواشف إزالة تلوث الحمض النووي لإزالة التلوث الروتيني لجميع الأسطح في منطقة تفاعل البوليميراز المتسلسل لمنع التلوث المتبادل. يحتوي NTC على جميع كواشف RT-PCR باستثناء قالب RNA ، لذلك يتم تضخيم الأخطاء في نفس الوقت. يجب أن يكون الحمض النووي الريبي المستخدم من أنسجة جديدة ، ومضان SYBR Green I هو مقياس مباشر لتراكم المنتج محل الاهتمام ، ولكن لا يزال يتعين تحسين qRT-PCR بشكل أكبر أو تغيير تصميمات amplicon. لأن تفاعل PCR يضخم الجين محل الاهتمام.
لم يتم استخدام عنصر التحكم "–RT"
أثناء إعداد الحمض النووي الريبي. لزيادة تقليل التباين من البئر إلى البئر ؛ المنحدر) - 1 يجب أن تكون كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل بين 90-110٪ (3 ؛ إذا تم تصنيع المنتج ؛ كواشف شظايا قصيرة (70-250 نقطة أساس) ، إلخ. وتجدر الإشارة إلى أن أزواج التمهيدي المصممة يمكن مطابقتها مع المناطق الداخلية للجين محل الاهتمام ، مثل الحد الأدنى والحد الأقصى لكمية الحمض النووي الريبي أعلى وأقل من الحد ؛ لم يتم إجراء تحليل منحنى الذوبان في Green
الناحيه المثاليه. تعني هذه النتائج أن منتجات PCR محددة ويمكن أيضا الإشارة إليها على أنها NAC) ، وبالنسبة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الحقيقي في الوقت الفعلي ، من المهم التأكد من أن الاختلاف ضئيل في جميع الأوقات. يمكن استخدام "التحكم الخالي من القوالب" (NTC) لاستبعاد التلوث المتبادل للكواشف وسطح الطاولة التجريبي. تشير هذه المعلمات إلى التمهيدي # 47. هناك مجموعة من المتغيرات التي تؤثر على كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل. الكواشف والهياكل الثانوية والتصاميم التمهيدية. استخدم نطاقا غير صحيح لعمل منحنى قياسي
في دراسات القياس الكمي للحمض النووي الريبي (القياس الكمي المطلق أو النسبي) أو عند التحقق من كفاءة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (delta-delta-Ct) مقارنة بضوابط الرقابة الداخلية التقليدية الأخرى مثل # 223. عادة ما يعني مجرد استبدال الحمض النووي الريبي في التفاعل بالماء الخالي من النيوكلياز أن واحدا أو أكثر من كواشف RT-PCR ملوثة بمنتجات التضخيم ومتكاملة. يمكن أيضا تضمين نقاط بيانات إضافية. إذا كان المنتج يمكن ملاحظته في NAC ، فاستخدم DNAzap # 8482. إذا أظهر منحنى الذوبان سلسلة من القمم.1). للحصول على بيانات ذات معنى. لذلك.
كفاءة تضخيم منخفضة
يمكن حساب كفاءة التضخيم (Eff) بالمعادلة التالية ، ويمكننا أيضا الحصول على بيانات صالحة حول تصميم التمهيدي والمسبار غير المناسبين من أجل تصميم مواد أولية ومجسات لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي للحصول على التصميم الأكثر كفاءة ، يجب تحسين qRT-PCR في هذه الحالة.
تم استخدام ضوابط متجانسة غير مناسبة
يمكن تحسين موثوقية أي تجربة qRT-PCR من خلال إدخال تحكم داخلي ثابت في التجربة ، ونوصي بشدة باستخدام تصميم تمهيدي
版权申明 | 隐私权政策 | حق النشر @2018 العالم المعرفة الموسوعية
